试验机构：中国农业科学院饲料研究所 

签发人：   齐广海                 

报告日期：2015年4月28日         

委托单位：山东龙昌动物保健品有限公司

试验概述表

胆汁酸在大口黑鲈饲料中的有效性评价试验报告

摘要

本研究依据《饲料原料和饲料添加剂水产靶动物有效性评价试验指南》对大口黑鲈进行70天有效性评价。受试物为山东龙昌动物保健品有限公司生产的胆汁酸，选择大口黑鲈（Micropterussalmoides）为靶动物。试验用大口黑鲈的初始体重为6.17±0.02g，通过在基础饲料中添加0、80、160、240、300、600 mg/kg的胆汁酸，经过70天饲养试验，研究其对大口黑鲈的生长性能、血浆脂肪代谢指标、抗氧化能力、肠道消化酶活性及胆酸含量、胆囊胆汁酸含量等的影响，以确定胆汁酸在水产饲料中添加的有效性。试验结果表明：饲料中添加适量胆汁酸可有效促进摄食和生长性能，但同时增加肝脏总胆汁酸含量。分别以特定生长率、摄食率和肝脏中总胆汁酸含量为指标，通过回归模型分析获得大口黑鲈饲料中胆汁酸最适添加量分别为440.5mg/kg、283.3mg/kg和253.8mg/kg。方差分析结果显示饲料中添加300mg/kg胆汁酸，大口黑鲈获得最高生长性能，且肝脏胆汁酸含量与D240组没有差异。在以上添加范围内，胆汁酸有效降低大口黑鲈肝脏中MDA含量，提高抗氧化能力；通过提高血浆中HDL-C含量显著促进脂肪代谢，同时有效提高了肠道淀粉酶和脂肪酶活性。综合生长性能，免疫抗氧化指标及胆汁酸在肝脏中的蓄积水平，建议大口黑鲈饲料中胆汁酸推荐添加量为253.8~283.3mg/kg，最高推荐剂量为300mg/kg。

前言

胆汁酸(Bile acid)分子结构具有两性，一端为烷基，具有亲油性，可以和油脂类结合；另一端为羟基和羧基，具有亲水性。两类性质不同的基团位于环戊烷多氢菲核的两侧，使胆汁酸具有较强的表面活性，能降低油水两相间的表面张力，促进脂类乳化，扩大脂肪和脂肪酶的接触面，加速脂类的消化吸收（HillMJ，1995）。胆固醇难溶于水，须掺入卵磷脂－胆汁酸盐微团中，使胆固醇通过胆道运送到小肠而不致析出。临床常用鹅脱氧脱酸及熊脱氧胆酸治疗胆固醇结石（Podda等，1989）。本试验以通过在基础饲料中添加0、80、160、240、300、600mg/kg的胆汁酸，对胆汁酸进行水产靶动物有效性评价试验，以确定其在水产饲料中添加的有效性。

1、材料与方法

1.1 试验鱼

试验用水产靶动物为大口黑鲈，购自佛山市三水白金水产种苗有限公司，试验正式开始前，试验鱼在养殖系统中暂养2周，暂养期间投喂不含外源胆汁酸的基础饲料。

1.2 受试物

试验所用胆汁酸由山东龙昌动物保健品有限公司提供，生产批号为20140116，胆汁酸的标示值95%，实测值99.1%。对该产品的相关卫生指标进行了检测，受试物重金属含量均符合国家饲料卫生标准，结果见表1。

1.3 试验饲料

在大口黑鲈的基础饲料中分别添加0、80、160、240、300、600mg/kg的胆汁酸，制成6种直径为2.0mm的膨化挤压浮性颗粒料，自然晾干后备用。6个处理组依次命名为D0、D80、D160、D240、D300、D600。

饲料中的水分、粗蛋白质、粗脂肪、灰分和总能分别采用105℃常压干燥法、凯氏定氮法、酸水解全脂肪测定法、550℃灼烧法和氧弹仪燃烧法测定。饲料配方及营养成分分析（见表2）。

*胆汁酸在预混料中添加。

*预混料为每千克饲料提供The premix provided the following per kg of diets: V_A 20mg, V_B1 10mg,V_B2 15mg, V_B6 15mg,V_B12 8mg, V_E 400mg, V_K3 20mg,V_D3 10mg,烟酸胺Niacinaminde 100mg, V_C酯1000mg,肌醇inositol 200mg泛酸钙Calcium pantothenate 40mg, 生物素biotin 2mg, 叶酸folic acid 10mg, 玉米蛋白粉150mg,硫酸铜CuSO₄.5H₂O 10mg，硫酸亚铁FeSO₄·H₂O 300mg,硫酸锌ZnSO₄·H₂O 220mg,硫酸锰MnSO₄·H₂O 25mg,碘酸钾3mg,亚硒酸钠Na₂SeO₃ 5mg,氯化钴CoCl₂·6H₂O 5mg,沸石粉Zeolite 332mg,硫酸镁MgSO₄ 2000mg。

1.4 分组及试验管理

试验在国家水产饲料安全评价基地（北京，南口）室内循环流水养殖系统中进行。随机挑选体质健康、个体均匀的大口黑驴（平均体重6.17±0.02g），分配到容积为0.26m3的圆锥形养殖桶中。本试验设计5个处理组，每处理组6个重复，每桶30尾鱼。

每天表观饱食投喂2次，投喂时间分别为8：00，16:00。定期检测水质，水质条件保持在溶氧DO＞7.0mg/L；总氨氮NH4+-N＜0.3mg/L；pH=7.5-8.5；水温25±3℃。

养殖试验从2014年7月14日到2014年9月21日，共70天。

2、评价指标

2.1生长

试验期间，记录每日摄食量，试验70天后，分别对各桶鱼称重并统计存活率、饲料系数、增重率、特定生长率等。

各指标计算公式：

存活率（Survival rate,SR, %）= 100×终末鱼数量／初始鱼数量；

相对增重率（Weight gain rate, WGR, %）= 100×(末鱼均重－初始鱼均重+死鱼重)／初始鱼均重；

特定生长率(Specific growth rate，SGR%/d) =100×[ln(FBW)-ln(IBW)]/t；其中，IBW为鱼体初始均重（g）；FBW为终末均重（g）；t为实验天数。

饲料系数（Feed conversion ratio, FCR）=摄食量／(末鱼重+死鱼重－初始鱼重)；

摄食率（Feeding rate,，FR% body weight/d）=100×C /(( W0+Wt +Wd)/2)/t，其中W0为鱼体初始总重（g）；Wt为终末总重（g）；Wd为死亡鱼体总重（g）；C为摄食量（g）；t为试验天数。

2.2 脏器指数

每桶随机取3尾鱼测量体长、体重、内脏重、肝脏重、脾脏重。

各指标计算公式：

肥满度（Condition factor,CF,g/cm3）=平均体重（g）／[平均体长（cm）]3；

肝体比（Hepatosomatic index, HSI,%）= 100×肝脏重／全鱼重。

脏体比（Viscerasomatic index，VSI %）=100×内脏重／体重。

脾脏指数（Spleen index，SSI,%）=100×脾脏重／全鱼重。

2.3 血浆脂肪代谢指标及抗氧化指标

每桶随机取3尾鱼，三氯叔丁醇麻醉后尾静脉取血，加入抗凝剂（2%NaF+4%草酸钾），用量为30ul/1ml血液。将抗凝血在4℃，4000rmp的条件下离心10min，取上清血浆保存于-80℃的冰箱中待测。检测指标有：血浆脂肪代谢指标：总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、总胆红素（TBILI）、高密度脂蛋白（HDL）、碱性磷酸酶（ALP）；血浆抗氧化指标：丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽-S转移酶（GST）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等。

2.4 肝脏抗氧化指标、淀粉酶、脂肪酶及胆汁酸含量

每桶随机取2尾鱼的肝脏，保存于-80℃的冰箱中。

肝脏组织样品制备：取组织0.3-0.5g，加入介质匀浆（匀浆介质根据检测指标确定），组织充分粉碎混匀后，3000rmp，离心10分钟，取上清液，进行检测。

2.5 肠道消化酶活性

每桶随机取2尾鱼的中肠和后肠（取中部靠中间1cm长作为中肠，取后一部分靠近肛门处1cm作为后肠），保存于-80℃的冰箱中。

肠道组织样品制备：取组织0.2-0.5g，加入介质匀浆（胆汁酸匀浆介质为无水乙醇，淀粉酶及脂肪酶匀浆介质为0.7%的生理盐水），组织充分粉碎混匀后，3000转/分钟，离心10分钟，取上清液，用于检测淀粉酶、脂肪酶活性。

2.6 胆囊胆汁酸含量

每桶随机取2尾鱼的胆囊的胆汁，保存于-80℃的冰箱中。

胆汁样品制备：取出胆汁，加入无水乙醇匀浆，充分混匀后，3000rmp，离心10分钟，取上清液，进行检测。本试验所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

3、数据统计

试验数据以平均数±标准误（Mean±S. E.）表示，所有数据用SPSS Statistics 17.0软件进行单因子方差分析（ANOVA），Duncan`s多重比较检验差异的显著性，显著性水平P<0.05。

4、试验结果

4.1饲料中添加不同剂量的胆汁酸对大口黑鲈生长性能的影响

在饲料中添加胆汁酸对大口黑鲈生长性能的影响见表3。

各组大口黑鲈存活率均高于96.67%，且各组没有显著差异。D300组末均重显著高于其他组，其WGR和SGR亦达到最高，并显著高于对照组和D80，D160组。该组摄食率也达到最高水平，并显著高于对照组（P<0.05）。各组饲料系数没有显著差异（P>0.05）。依据特定生长率和摄食率结果进行回归模型分析，获得饲料中胆汁酸最适添加量为440.5mg/kg和283.3mg/kg（图1和图2）。

4.2 饲料中添加不同剂量的胆汁酸对大口黑鲈形体指标的影响

饲料中添加胆汁酸对大口黑鲈形体指标的影响见表4。

肝体比呈现先上升后下降趋势，D80组肝体比显著高于D240，D300和D600组，和对照组没有显著差异。6个处理组之间的肥满度、脾脏指数、脏体比均没有显著差异（P>0.05）。

4. 3 饲料中添加不同剂量的胆汁酸对大口黑鲈血浆脂肪代谢指标及抗氧化功能的影响

饲料中添加胆汁酸对大口黑鲈血浆脂肪代谢指标的影响见表5。

各个处理组之间TG和ALP没有显著差异（P>0.05）。TC和HDL-C随饲料中胆汁酸的添加水平呈上升趋势，并在D240组达到最高(P<0.05)；TBILI呈现不规律显著差异(P<0.05)，其中D0组与其余各组均差异不显著（P>0.05）。

饲料中添加胆汁酸对大口黑鲈血浆抗氧化指标的影响见表6。

由表6可以得出，MDA、GST各组均无差异（P>0.05），SOD、T-AOC、GSH-PX呈显著上升趋势（P<0.05）。

4.4 饲料中添加不同剂量的胆汁酸对大口黑鲈肝脏组织中抗氧化指标及胆汁酸和胆固醇含量的影响

饲料中添加胆汁酸对大口黑鲈肝脏抗氧化指标及胆汁酸和胆固醇含量的影响见表7。

由表7可得，GSH-PX、T-AOC呈现不规律显著差异（P＜0.05），且D0组与其余各组无显著性差异。D600组GST最低，并显著低于D0,D160和D240组（P＜0.05）。MDA呈下降趋势且D300组最低。SOD呈显著上升趋势（P＜0.05）。肝脏中TC没有显著差异，肝脏TBA随饲料中胆汁酸的添加呈现上升趋势，并在D240组达到平台期（P>0.05）。依据折线回归模型，以大口黑鲈肝脏总胆汁酸含量为指标时，饲料中胆汁酸的最适添加量为253.8mg/kg（图3）。

4.5 饲料中添加不同剂量的胆汁酸对大口黑鲈肠道消化酶活性及胆囊胆汁酸含量的影响

由表8可见，大口黑鲈中肠淀粉酶含量显示不规律上升趋势，D300组达到最高（P<0.05），中肠脂肪酶显示不规律性差异（P<0.05）。后肠淀粉酶在D600达到最高，显著高于其他各组；后肠脂肪酶呈先升后降的趋势，D80组达到最高，但各组均与对照组没有显著差异。各组胆囊胆汁酸含量呈显著上升趋势，且最高的D600组胆囊胆汁酸含量约为对照组的4.9倍。

5. 结论

试验结果表明：饲料中添加适量胆汁酸可有效促进摄食和生长性能，但同时增加肝脏总胆汁酸含量。分别以特定生长率、摄食率和肝脏中总胆汁酸含量为指标，通过回归模型分析获得大口黑鲈饲料中胆汁酸最适添加量分别为440.5mg/kg、283.3mg/kg和253.8mg/kg。方差分析结果显示饲料中添加300mg/kg胆汁酸，大口黑鲈获得最高生长性能，且肝脏胆汁酸含量与D240组没有差异。在以上添加范围内，胆汁酸有效降低大口黑鲈肝脏中MDA含量，提高抗氧化能力；通过提高血浆中HDL-C含量显著促进脂肪代谢，同时有效提高了肠道淀粉酶和脂肪酶活性。综合生长性能，免疫抗氧化指标及胆汁酸在肝脏中的蓄积水平，建议大口黑鲈饲料中胆汁酸推荐添加量为253.8~283.3mg/kg，最高推荐剂量为300mg/kg。